広島大学
大学院統合生命科学研究科
分子栄養学研究室
Last Updated:2023/11/25
Yazawa Seminar
NLRP3 inflammasome activation drives tau pathology
NLRP3インフラマソームの活性化はタウ病変の形成を強力に促進する
Christina Ising, Carmen Venegas, Shuangshuang Zhang, Hannah Scheiblich, Susanne V. Schmidt, Ana Vieira-Saecker, Stephanie Schwartz, Shadi Albasset, Róisín M. McManus, Dario Tejera, Angelika Griep, Francesco Santarelli, Frederic Brosseron, Sabine Opitz, James Stunden, Maximilian Merten, Rakez Kayed, Douglas T. Golenbock, David Blum, Eicke Latz, Luc Buée & Michael T. Heneka
Nature volume 575, pages669–673(2019)
Introduction
アルツハイマー病は、認知症の約半数を占める神経変性疾患であり、高齢化が進む現代社会において治療法の開発は大きな課題となっている。発症の詳しいメカニズムは未だ解明されていないが、老人班におけるamyloid-beta(Aβ)の蓄積を引き金とし、神経原線維における過剰にリン酸化されたタウタンパク質の凝集、神経変性と認知機能の低下が生じるというアミロイドカスケード仮説が有力であると考えられている。さらに、近年、多くの神経変性疾患の発症と進行に神経における炎症プロセスが関与していることが明らかとなってきた。
NLRP3インフラマソームは、パターン認識受容体であるNLRP3が、アダプター分子であるASCを介して、pro-caspase-1を会合させることで形成される巨大な複合体である。インフラマソームの形成に伴ってcaspase-1が切断され、その酵素活性により細胞内に存在するpro-IL-1βは成熟化され、炎症性サイトカインであるIL-1βの放出が誘導される。このNLRP3インフラマソームの活性化は、Aβやα-synuclein、prion proteinなどのアミロイド形成タンパク質や、SOD、ATP、感染に関与する補体系などをNLRP3が感知することによって誘導されることが明らかとなっている。
そして近年、アルツハイマー病におけるNLRP3インフラマソームの関与が明らかとなってきている。2013年には、Nlrp3またはCaspase-1の全身ノックアウトにより、アルツハイマー病モデルであるAPP/PS1マウスの空間記憶障害が改善され、Aβのクリアランスが亢進することが示された(Heneka et al.,2013)。さらに、2017年には、ASCの全身ノックアウトまたは抗ASC抗体の投与により、APP/PS1マウスにおけるAβ病変の拡大が阻止されたことから、NLRP3インフラマソームがマウスにおいてAβ病変の発生と進行に必須であることが示された(Venegas et al.,2017)。
一方、NLRP3インフラマソームがタウ病変に与える影響は不明であることから、この研究では、Aβの蓄積を伴わず、ヒト型の変異タウ遺伝子を発現し、時間経過とともにタウ病変を進行するTau22マウスを用いて研究が行われた。その結果、NLRP3インフラマソームの機能喪失が、タウタンパク質に対するキナーゼ活性、およびホスファターゼ活性を調節して、タウタンパク質の過剰リン酸化および凝集を抑制することが明らかとなった。また、線維化したAβを含む脳のホモジェネートを脳内へ注入すると、NLRP3依存的にタウ病変が誘導された。これらの結果は、タウ病変の発症にNLRP3インフラマソームの活性化が重要な役割を担っていることを明らかにするものである。さらに、神経細胞における神経原線維変化がAβによるミクログリアの活性化の下流で起こっていることを実証し、アミロイドカスケード仮説におけるAβの蓄積がアルツハイマー病の発症の引き金となるという点を支持している。以上の結果から、NLRP3がアルツハイマー病の新たな治療標的となる可能性が示された。
Result
FTDにおけるNLRP3インフラマソーム活性
まず、タウオパチー患者におけるNLRP3インフラマソームの役割を明らかにするため、FTD(前頭側頭型認知症)患者の皮質サンプルを解析したところ、切断されたcaspase-1およびIL-1β(p17)の増加が認められた(fig.1a,b,c,d)。この結果は、タウオパチー患者の脳におけるNLRP3インフラマソームの活性化を示した。
次に、Tau22マウス(ヒト型の変異タウ遺伝子を発現し、時間経過とともにタウ病変を進行するモデル)を使用し、NLRP3インフラマソームの活性化を解析した。その結果、3ヵ月齢と比較して、11ヶ月齢のTau22マウスの脳サンプルでは、切断されたcaspase-1、およびASCのタンパク質レベルの増加が認められた(fig.1e,f)。さらに、11ヶ月齢のTau22マウスでは、野生型マウスと比較して、ミクログリア細胞外のASCスペック(NLRP3インフラマソームの活性化によりミクログリア細胞から放出されるASCの凝集体)が大幅に増加し(fig.1g,h)、NLRP3インフラマソームの活性化が明らかとなった。
次に、NanoString解析により、3ヶ月齢、8ヶ月齢、11ヶ月齢の野生型マウスおよび同月齢のTau22マウスの脳サンプルにおける神経炎症に関連する遺伝子の発現を網羅的に解析し、主成分分析を行ったところ、加齢による遺伝子の発現パターンの変化が明らかとなった。そこで、野生型マウスの3ヶ月齢対11ヶ月齢、およびTau22マウスの3ヶ月齢対11ヶ月齢における遺伝子発現パターンの変化を可視化するため、遺伝子ネットワーク解析を行った(fig1.i)。その結果、Caspase-1とIL-1βは11ヶ月齢で発現上昇した遺伝子群の中に存在し、NLRP3インフラマソームの活性化は、神経炎症や神経変性プロセスだけでなく、通常の加齢に中心的な役割を果たす可能性があることが示された。
次に、タウ病変の進行過程において、3ヶ月、8ヶ月、11ヶ月齢の海馬CA1領域における過剰リン酸化タウの陽性ニューロン付近のミクログリアの形態を観察した。野生型マウスおよびTau22マウスにおけるミクログリア(lba1)およびリン酸化タウ(AT8)の免疫蛍光染色を行った結果(fig.1j)、11ヶ月齢の野生型マウスに対して同月齢のTauマウスでは、細胞体体積に対する分岐体積の割合が減少し(fig.1k,l)、ミクログリアの形態変化が認められた。
以上の結果から、FTD患者およびTau22マウスの脳におけるNLRP3インフラマソームの活性化が示された。また、Tau22マウスの過リン酸化タウ陽性ニューロン付近のミクログリアの形態が変化していることが明らかとなった。
Fig. 1: NLRP3 inflammasome is activated in patients with FTD and Tau22 mice.
a, Immunoblot detection of caspase-1 and β-actin in cortex of patients with FTD, Alzheimer’s disease (AD) and controls (con.). b, Quantification of control and FTD data from a. Box plots show 25th and 75th percentiles. n = 5 for controls, n = 9 for FTD, **P = 0.0018. c, Immunoblot analysis of IL-1β (p17) and β-actin in cortex of control, mild cognitive impairment (MCI), AD and FTD patients. d, Quantification of data from c. n = 6 for control and MCI, n = 7 for AD, n = 11 for FTD. **P = 0.0049, *P = 0.0269, ***P = 0.0009. e, Immunoblot detection of caspase-1, ASC and β-actin in hippocampi of Tau22 mice (3 and 11 months). f, Quantification of data from e. n = 5, ***P = 0.0004, *P = 0.0281. g, Immunohistochemical staining for microglia and ASC close to the CA1 region in wild-type (WT) and Tau22 mice. Scale bar, 10 μm. h, Quantification of ASC specks per microglia from staining in g. n = 6, ****P < 0.0001. i, Gene network analysis of regulated genes at 3 versus 11 months in wild-type and Tau22 mice identified by NanoString analysis. j, Immunohistochemical staining for microglia and phosphorylated tau (AT8) in wild-type and Tau22 mice. n = 8. Scale bar, 10 μm. k, Reconstruction of microglia (green-blue) in wild-type and Tau22 mice close to an AT8-positive neuron (magenta). Scale bar, 20 μm. l, Quantification of soma to branch volume of microglia located close to the CA1 region in wild-type mice or microglia in contact with AT8-positive cells in Tau22 mice. n = 8, *P = 0.0491. For gel source data, see Supplementary Fig. 1. Data are mean ± s.e.m. and were analysed by two-tailed unpaired t-test (b, f, h, l) or one-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey’s test (d).
NLRP3の欠損はタウ病変の形成を抑制する
NLRP3インフラマソームがタウオパチーの病因に関与しているかどうかを評価するため、Tau22マウスとPycardまたはCias1が欠損しているマウスを交配した(Tau22/Asc-/-マウス、 Tau22/Nlrp3-/-マウス)。Pycard、およびCias1はインフラマソーム構成要素としての生理機能が報告されている。11ヶ月齢Tau22マウスおよびTau22/Asc-/-マウス、Tau22/Nlrp3-/-マウスの海馬におけるリン酸化タウ(AT8)の免疫組織化学解析を行った結果、Tau22/Asc-/-マウスおよびTau22/Nlrp3-/-マウスではタウの過剰リン酸化レベルの低下が認められた(fig.2a,b)。さらに、チオフラビン染色によって凝集タウレベルを解析した結果、同様に、凝集タウレベルの低下が認められた(fig.2c,d)。
さらに、モリス水迷路試験より、空間記憶能力の解析を行った(fig.2e)。試験に供するマウスは、円形のプールの第1象限(Q1)には避難することのできるプラットフォームが位置しているということを試験前に繰り返し経験させ、学習している。試験では、プラットフォームを隠した状態でマウスを泳がせ、Q1での滞在時間の長さから空間記憶能力を評価する。正常の空間記憶能力を持つマウスであれば、a.o.(Q1以外のすべての象限)よりもQ1の滞在時間が有意に長くなる。結果として、Tau22マウスでは、Q1およびa.o.の滞在時間に有意な差はなく、空間記憶能力の低下が観察されたが、Tau22/Asc-/-マウスおよびTau22/Nlrp3-/-マウスでは正常値であった(fig.2f)。これにより、NLRP3インフラマソーム構成要素の欠損による空間記憶障害の改善が明らかとなった。
Fig. 2: Loss of NLRP3 inflammasome function decreases tau pathology and prevents cognitive decline.
a, Immunohistochemical staining for phosphorylated tau (AT8) in mouse hippocampi. Scale bar, 500 μm. b, Quantification of AT8 in hippocampus and CA1 region shown in a. n = 17 for Tau22, n = 15 for Tau22/Asc−/−, n = 8 for Tau22/Nlrp3−/−. Hippocampus: **P = 0.0055, CA1: *P = 0.0278, **P = 0.0059. c, Staining with thioflavine S (thioS) (aggregated tau) of mouse hippocampi. Scale bars, 500 μm (top) and 100 μm (bottom). d, Quantification of thioflavine-S-positive cells in CA1 region shown in c. n = 12 for Tau22, n = 5 for Tau22/Asc−/− and Tau22/Nlrp3−/−. Tau22 versus Tau22/Asc−/−: *P = 0.0240, Tau22 versus Tau22/Nlrp3−/−: *P = 0.0444. e, Example of movement of mice at probe trial day 9 of the Morris water maze test. f, Quantification of time spent in quadrant 1 (Q1) versus all other quadrants (a.o.) at probe trial day 9. n = 12 for wild-type, Nlrp3−/−, Tau22/Asc−/−, Tau22/Nlrp3−/−, n = 14 for Asc−/−, n = 16 for Tau22. ***P = 0.0001, ****P < 0.0001, Asc−/−: **P = 0.0065, Nlrp3−/−: **P = 0.0012. Data are mean ± s.e.m. and were analysed by one-way ANOVA with Tukey’s test (b, d) or two-tailed unpaired t-test (f).
NLRP3はキナーゼとホスファターゼを調節する
タウタンパク質のリン酸化を調節するキナーゼ活性、およびホスファターゼ活性を解析するため、11ヶ月齢のTau22マウス、および同月齢のTau22/Asc-/-マウス、Tau22/Nlrp3-/-マウスの海馬サンプルのイムノブロッティング解析を行った(fig.3a)。その結果、Tau22/Asc-/-マウスおよびTau22/Nlrp3-/-マウスで、タウタンパク質の脱リン酸化酵素であるprotein phosphatase 2A(PP2A)の不活性型(demethylated)レベルが低下した(fig.3b)。また、これはPP2Aのネガティブレギュレーターであるprotein phosphatase methylesterase 1(PME-1)の低レベルを伴っていた(fig.3c)。さらに、glycogen synthase kinase 3β(GSK-3β)のキナーゼ活性はTau22/Nlrp3-/-マウスで低下していた(fig.3d)が、cyclin-dependent kinase 5(CKD5)とp38のキナーゼ活性は変化しなかった(fig.3e,f)。一方、キナーゼ活性を有するCa²⁺/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ-α(CaMKⅡ-α)は、Tau22/Asc-/-マウスおよびTau22/Nlrp3-/-マウスの両方で低下していたことから(fig.3g)、Tau22/Asc-/-マウスおよびTau22/Nlrp3-/-マウスのCA1領域のSer416におけるタウリン酸化レベルの低下(fig.3h,i)に関与していると考えられる。
次に、タウタンパク質のキナーゼ活性、およびホスファターゼ活性の調節をより詳細に解析するため、さらにin vitro実験を行うことにより、in vivoにおける変化を検証した。野生型マウスおよびAsc-/-マウス、Nlrp3-/-マウスから単離した初代ミクログリア細胞にNLRP3インフラマソームを誘導するため、LPS、およびATP添加による活性化を行い、そこから回収した培養上清を初代マウス海馬ニューロンに添加した(fig.4a 概略図)。野生型マウスのミクログリアの培養上清で処理した場合、Ser396およびSer404がリン酸化されたタウ(PHE-1)レベルの増加、並びに、活性型CaMKⅡ-αの発現レベルの増加が認められたが、Asc-/-マウスやNlrp3-/-マウスでは変化しなかった(fig.4b,c)。さらに、IL-1βシグナル伝達系におけるニューロンIL-1受容体、またはその下流エフェクターであるinterleukin-1 receptor associated kinase(IRAK4)やmitogen-activated protein kinase kinase1/2(MEK1/2)の阻害は、CaMKⅡ-αの活性化を抑制した(fig.4d,e)。これは、ミクログリア由来のIL-1βがタウ病変を悪化させることを示している。
また、Aβなどの他のアミロイド形成タンパク質は、NLRP3インフラマソームを活性化することが知られている。今回、Tau22マウスの脳のホモジェネートによる処理によって、ミクログリアからのIL-1βの分泌が誘導されたことから、タウタンパク質自身もNLRP3インフラマソームを活性化することが明らかになった(extended data fig.10b)。さらに、関与するタウタンパク質の分子種を決定するため、野生型タウとP301S変異タウをモノマー体、オリゴマー体、フィブリル体を初代培養ミクログリアに添加した結果、タウのモノマー体とオリゴマー体は、ASCおよびNLRP3に依存してIL-1βの分泌量を増加させた(extended data fig.10c,d)。
Fig. 3: Nlrp3- and Asc-knockout inhibits CaMKII-α and promotes phosphatase activity.
a, Immunoblot analysis of mouse hippocampi (11 months) stained for demethylated PP2A subunit C, total PP2A subunit C, PP2A methylesterase (PME-1), β-actin, GSK-3β phosphorylated at Tyr216 (pGSK-3β), total GSK-3β, p25/p35, phosphorylated p38 (p-p38), total p38, calmodulin-dependent protein kinase II α phosphorylated at Thr286 (pCaMKII-α) and total CaMKII-α. b–g, Quantification of the enzyme activities or abundance shown in a. n = 5. PP2Ac: Tau22 versus Tau22/Asc−/−: *P = 0.0286, Tau22 versus Tau22/Nlrp3−/−: *P = 0.0144, PME1: *P = 0.0398, GSK-3β: *P = 0.0205, CaMKII-α: Tau22 versus Tau22/Asc−/−: **P = 0.0055, CaMKII-α Tau22 versus Tau22/Nlrp3−/−: **P = 0.0012. h, Immunohistochemical staining for tau phosphorylated at Ser416 (Tau–pSer416) in mouse hippocampi. Scale bar, 500 μm. i, Quantification of Tau–pSer416 in CA1 region shown in h. n = 15 for Tau22, n = 14 for Tau22/Asc−/−, n = 13 for Tau22/Nlrp3−/−. Tau22 versus Tau22/Asc−/−: *P = 0.0314, Tau22 versus Tau22/Nlrp3−/−: *P = 0.0476. For gel source data, see Supplementary Fig. 1. Data are mean ± s.e.m. and were analysed by one-way ANOVA with Tukey’s test.
Extended Data Fig. 10: Tau can activate the NLRP3 inflammasome.
b, IL-1β levels in conditioned medium of primary wild-type microglia primed with LPS and treated with hippocampus homogenate from either 11-month-old wild-type or Tau22 mice. n = 5 for primed, n = 4 for wild-type and Tau22 homogenate treated microglia. Primed versus Tau22: **P = 0.0092, wild type versus Tau22: *P = 0.0276. c, IL-1β levels in conditioned medium of primary wild-type, Asc–/– and Nlrp3–/– microglia primed with LPS and treated with different forms of 2 μM recombinant wild-type tau (tau WT). n = 3 for Asc–/– and Nlrp3–/– microglia treatments and wild-type oligomer treatment, n = 8 for all other wild-type treatments. Wild-type primed versus wild-type monomers: **P = 0.0011, wild-type primed versus wild-type oligomers: ***P = 0.0007, wild-type monomers versus Asc–/– and Nlrp3–/– monomers: **P = 0.0011, wild-type monomers versus wild-type fibrils: *P = 0.0388, wild-type oligomers versus Asc–/– and Nlrp3–/– oligomers: ***P = 0.0004, wild-type oligomers versus wild-type fibrils: *P = 0.0112. d, IL-1β levels in conditioned medium of primary wild-type, Asc–/– and Nlrp3–/– microglia primed with LPS and treated with different forms of 2 μM recombinant tau with a P301S (tau P301S) mutation. n = 8 for wild-type microglia treatments, n = 3 for Asc–/– and Nlrp3–/– microglia treatments, ***P = 0.0002, **P = 0.0018.
NLRP3はAβ誘発性のタウ病変を媒介する
NLRP3インフラマソームの活性化がAβ誘発のタウシーディング(タウの取り込みと放出の課程)に及ぼす影響を検討するため、まず、Aβのフィブリル体で処理した初代野生型ミクログリアの培養液にIL-1βが放出されていることを示し、Aβ原線維がNLRP3インフラマソームを活性化することを明らかにした(fig.4f)。次に、野生型マウスまたはAPP/PS1マウス(ADモデル)の脳ホモジェネートを3か月齢のTau22マウスおよびTau22/Asc-/-マウス、Tau22/Nlrp3-/-マウスの海馬に注入し、5ヶ月後のCA1領域のリン酸化タウ(AT8)を免疫組織化学染色により観察した(fig.4g,h)。その結果、APP/PS1脳ホモジェネートの注入は、野生型マウスにおいてタウの過剰リン酸化を効率的に誘導したのに対し、Tau22/Asc-/-マウスおよびTau22/Nlrp3-/-マウスでは有意な変化が認められなかった(fig.4i)。これは、NLRP3活性がAβ-タウカスケードにおいて必須であることを示唆している。
Fig. 4: Inflammasome function is necessary for Aβ-induced tau pathology.
a, Schematic illustrating the experimental set-up used for experiments shown in b–e. b, c, Immunoblot analysis and quantification of tau phosphorylated at Ser396 and Ser404 (PHF-1) and pCaMKII-α in treated neurons (primary wild-type microglia (control), LPS- and ATP-activated wild-type microglia (wild type + ATP), LPS- and ATP-activated Asc- or Nlrp3-knockout microglia (Asc−/− + ATP or Nlrp3−/− + ATP)). n = 4 in b, with control versus wild type + ATP: *P = 0.0235, wild type + ATP versus Asc−/− + ATP: **P = 0.0072, wild type + ATP versus Nlrp3−/− + ATP: **P = 0.0064. n = 5 in c with **P = 0.0022, *P = 0.0454. d, Immunoblot analysis and quantification of pCaMKII-α in neurons treated with an IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) or the corresponding isotype control in addition to conditioned medium from wild-type microglia. n = 3, IgG control + ATP versus IgG control and versus IL-1ra: **P = 0.0015, IgG control + ATP versus IL-1ra + ATP: **P = 0.0044. e, Immunoblot analysis and quantification of pCaMKII-α in neurons after treatment with DMSO, IRAK4 inhibitor (inhib.) PF06650833 or MEK1/2 inhibitor UO126 in addition to conditioned medium from wild-type microglia. n = 3 for MEK1/2 inhibitor, n = 4 for all other groups, control versus control + ATP: **P = 0.0011, control versus DMSO + ATP: **P = 0.0040, control + ATP versus IRAK4 inhibitor + ATP: **P = 0.0087, control + ATP versus MEK1/2 inhibitor + ATP: *P = 0.0309, DMSO + ATP versus IRAK4 inhibitor: *P = 0.0338. f, IL-1β levels in conditioned medium of primary wild-type microglia treated with LPS and 10 μM Aβ fibrils. n = 4, ****P < 0.0001. g, Schematic for injection model. h, Immunohistochemical staining for phosphorylated tau (AT8) of CA1 region of mice injected with either APP/PS1 or wild-type brain homogenates. Scale bar, 250 μm. i, Quantification of AT8 in CA1 region of injected mice shown in h. n = 18 sections of n = 6 mice for Tau22, n = 30 sections of n = 6 mice for Tau22/Asc−/−, n = 25 sections of n = 6 mice for Tau22/Nlrp3−/−. *P = 0.0490, ****P < 0.0001, Tau22 + APP/PS1 versus Tau22/Asc−/− + APP/PS1: **P = 0.0034, Tau22 + APP/PS1 versus Tau22 + wild type: **P = 0.0071. For gel source data, see Supplementary Fig. 1. Data are mean ± s.e.m. and were analysed by one-way ANOVA with Tukey’s test (b–e, i) or two-tailed unpaired t-test (f).
Discussion
NLRP3の活性化は、IL-1β依存的にタウキナーゼを介してタウタンパク質の過剰リン酸化と凝集を誘導することが明らかとなった。また、神経原線維変化がAβによるミクログリアの活性化の下流で引き起こされることを明らかにし、Aβの蓄積がアルツハイマー病の発症の引き金となるというアミロイドカスケード仮説を支持した。以上の結果から、NLRP3がアルツハイマー病の新規治療標的となる可能性が示唆された。
さらに、タウのモノマー体とオリゴマー体はNLRP3を活性化することにより、ミクログリアに直接影響を与えることも明らかにした。非原線維性タウはニューロンによって活発に放出される可能性があることが以前の研究により報告されており、これらがタウオパチーの慢性的なミクログリアの活性化に関与している可能性を示すものである。さらに、この経路はNLRP3阻害剤やミクログリアへのタウタンパク質の結合阻害によって遮断できる可能性が示された。